همسانه سازی و بیان ژن کد کننده اگزوسلولاز cel6b باکتری thermobifidia fusca در مخمر pichia pastoris

بیوماس لیگنوسلولزی فراوانترین ترکیب آلی بر روی زمین بوده و با توجه به چشم انداز اتمام سوختهای فسیلی و بازار متغیر انرژی، به منظور تامین سوخت مایع حمل و نقل بسیار مورد توجه قرار دارد. هیدرولیز آنزیمی سلولز به مخلوطی از آنزیم های اندوگلوکاناز، اگزوگلوکاناز یا سلوبیوهیدرولاز (نوع i و ii) و بتاگلوکوزیدازها نیاز دارد. از آنجایی که فرآورده های گلوکز و سلوبیوز مهارکننده های قوی در هیدرولیز آنزیمی سلولز هستند، ترکیب مراحل ساکاریفیکاسیون و تخمیر که معمولا در مخمرها صورت می گیرد، می تواند به عنوان راهبردی در هیدرولیز موثر سلولز و تبدیل آن به اتانول باشد. پژوهش حاضر نیز جهت تولید سلوبیوهیدرولاز نوع ii مقاوم به حرارت از اکتینومیست thermobifidia fusca با نام cel6b در pichia pastoris به صورت خارج سلولی انجام شد. هم چنین بیان این آنزیم در باکتریescherichia coli نیز با سازه اهدا شده توسط دیوید بی ویلسون از دانشگاه کرنل با نام psz143 بررسی و مقایسه شد. به منظور بیان در مخمر، ژن سلوبیوهیدرولاز cel6b موجود در سازه psz143، با واکنش pcr تکثیر و در نهایت به درون ناقل مخصوص مخمری، ppicz?a ، همسانه سازی شد. سازه نوترکیب حاوی ژن cel6b و توالیهای سیگنال ?-factor، c-myc و 6xhis tag، پس از انتقال به باکتری jm109 e. coli و انتخاب باکتری های نوترکیب از روی محیط کشت lb دارای µg/ml5/0 بلئومایسین، تکثیر شد. سازه نوترکیب پس از خطی شدن، با استفاده از الکتروپوریشن به سویه های gs115 و km71h مخمر p. pastoris منتقل شد. تراریخته های مخمری پس از 3 روز رشد، از روی ظروف ypds دارای µg/ml 100 زئوسین انتخاب شدند. هرکلنی پس از رشد در محیط کشت bmgy تا od600=2، به محیط کشت بیانیbmmy دارای یک درصد متانول، تلقیح شد. بهترین کلنی از نظر فعالیت سلوبیوهیدرولاز بر روی سوبسترای پنبه پیش تیمار شده فسفریک اسیدی (pc) و روش dns انتخاب شد. سپس بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم نیز با روش dns تعیین شد. در نهایت نتایج نشان داد که سلوبیوهیدرولاز cel6b در سازه psz143 ، در باکتری به صورت داخل سلولی سنتز می شود که علت آن توالی سیگنال طبیعی این ژن است که مربوط به باکتری گرم مثبت t. fusca است که نمی تواند در باکتری گرم منفی (e. coli bl21(de3 باعث ترشح این آنزیم به محیط کشت شود. نتایج بیان در مخمر نشان داد، بیشترین میزان فعالیت سلوبیوهیدرولاز نوترکیب در محیط کشت، بر حسب مقدار سلوبیوز تولید شده در سویه های gs115 و km71h ، بر روی pc در دمای c° 50 و به مدت 16 ساعت، به ترتیب 98/1 و u(?mol/min)/ml 475/0 می باشد که این میزان در مقایسه با فعالیت آنزیم تولید شده در باکتری به مراتب کمتر است. فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده مربوط به کلنی های مخمری مورد بررسی کم بود که می تواند به علت عدم بهینه سازی توالی ژنی آنزیم در مخمر باشد. نمونه مربوط به کلنی پر محصول سویه gs115 بر روی ژل sds-page بارگزاری و بیان آنزیم تایید شد و سپس نتایج بهترین غلظت متانول و بهترین روز بیان آنزیم با همین سویه، در روز چهارم بعد از القا با 3 درصد متانول (v/v) به دست آمد. به علت اینکه توالی ژن cel6b برای بیان در یوکاریوت بهینه نشده بود، ممکن است توالی همسانه شده در وکتور مخمری حاوی کدون هایی باشد که به ندرت در p. pastoris استفاده می شود و یا اینکه عناصر محدود کننده بیان در داخل توالی کد کننده حضور داشته باشند، که می تواند از دلایل فعالیت کمتر این سلوبیوهیدرولاز در مخمر p. pastoris باشد.